東アジアに共通するアルデヒドデヒドロゲナーゼ 2*2 変異体は慢性光により心室不整脈を促進する

Jun 21, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 610 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

慢性的な大量アルコールの使用は致死性不整脈と関連しています。東アジアに多く見られるアルデヒド脱水素酵素欠損症（ALDH2*2）が、低レベルのアルコール摂取によって引き起こされる不整脈の発生に寄与しているかどうかは、依然として不明である。今回我々は、ALDH2 rs671を保有する59人の常習的アルコール使用者が、137人のALDH2野生型（Wt）常習的アルコール使用者および57人の非アルコール使用者と比較して、より長いQT間隔（補正）およびより高い心室頻脈性不整脈イベントを有することを示す。特に、習慣的な軽度から中度のアルコール摂取を示すヒトALDH2変異体では、QT延長と心室性期外収縮のリスクが高いことが観察されました。我々は、4％エタノールで処理したマウスALDH2*2ノックイン（KI）モデルを用いて、ヒトの電気生理学的QT延長表現型を再現しました。このモデルでは、筋鞘のNav1.5、Kv1.4の顕著な下方制御を伴う側面化の増加にもかかわらず、コネキシン43の総量が著しく減少していることが示されています。 EtOH処理Wtマウスと比較したKv4.2発現。全細胞パッチクランプは、EtOH 処理された ALDH2*2 KI マウスにおいてより顕著な活動電位延長を明らかにします。プログラムされた電気刺激により、ローターは、心室性不整脈のエピソードの数と持続時間が増加するとともに、EtOH 処理された ALDH2*2 KI マウスでのみ誘発可能です。本研究は、ALDH2欠損集団に対する安全な飲酒ガイドラインの策定と、これらの被験者に対する新規の保護剤の開発に役立ちます。

心血管疾患による大きな負担と、大量飲酒者やアルコール中毒者の年間死亡者数があまり認識されていないにもかかわらず1、アルコール摂取の正確な安全用量は依然として不明であり、地理的に異なります2、3。アルコール摂取と心血管系死亡率との関連は、J 曲線に従うようです 3。最近の大規模な多民族疫学研究では、これまで比較的無害だと考えられていたアルコール摂取量が早期死亡リスクの上昇と関連していることが示されました4。以前の実験データとシミュレーションモデルは、アルコール関連の不整脈誘発効果を、高用量のアルコールへの急性曝露（血中アルコール濃度 > 20 mM）または慢性的な大量飲酒（1 日あたり 6 杯以上）と関連付けています。上記の条件下でのアルコールへの曝露によって誘発される電気生理学的不安定性は、イオンチャネル恒常性の調節不全、活動電位の延長、リエントラント興奮と関連しており、これらすべてが心室性不整脈（VA）や心臓突然死に対する脆弱性の増加をもたらすと報告されています5 、6、7。現在、慢性的なアルコール摂取の正確な毒性閾値と、アルコール摂取によって引き起こされる重篤だがまれな生命を脅かす不整脈であるVAの発症とのメカニズムの関係は、依然として論争の的となっている8,9。

ミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ (ALDH2) は、エタノール解毒と虚血再灌流傷害に対する心臓保護において極めて重要な役割を果たしています 10,11。 ALDH2 rs671 変異体、または ALDH2*2 対立遺伝子は、不活性 ALDH2 酵素をコードし、アルコールによる顔面紅潮反応を引き起こす、ヒトに最も一般的で民族特異的な酵素の 1 つであり、世界中で約 5 億 4,000 万人の東アジア人が罹患しています12。 ALDH2*2 変異体は、アルコールの毒性作用に対する感受性が高まっているため、最近大きな注目を集めています 13,14。アルコール摂取によって引き起こされる用量関連心血管合併症を調査した最近の疫学分析では、遺伝的背景に関する十分な情報が不足しているために、これらの関係の解釈が偏っている可能性があることが示されました15。我々は以前、動物のエタノール高摂取モデルにおいて、心室電気伝導の障害と再突入が推定上の不整脈誘発メカニズムであることを実証した16。私たちは、ALDH2欠損症を示すヒトでは、電気生理学的特徴と再突入機構の調節不全により、1日あたり標準的な飲み物2杯未満または適度な飲酒など、より低いアルコール用量でVAを引き起こす可能性があると推測しました。私たちは、マウスALDH2*2ノックイン（KI）モデルを用いて、慢性低度から中度のアルコール曝露下でのALDH2欠損症とVAの関係を調べるための機構実験研究を実施しました。また、我々は、軽度から中度のアルコール摂取量およびALDH2 rs671遺伝子型が知られている196人のヒト被験者のコホートにおけるこの関係と不整脈のリスクを調査するために、5年間の臨床縦断研究も実施した。

習慣的に軽度から中度のアルコール摂取量（中央値：13.9 [7.6～29.3] g/日、標準飲料 1.2 [0.6～2.4]/日）を持つ成人 196 人（30.1%）が ALDH2 rs671 バリアント対立遺伝子を持っていました（ [ALDH2 Vt]; G/A または A/A)、137 (69.9%) は ALDH2 野生型でした ([ALDH2 Wt]; G/G、表 1)。アルコール非使用者 57 人のうち、28 人 (49.1%) が ALDH2 Vt、29 人 (50.9%) が ALDH2 Wt でした。これらの結果は、常習的アルコール使用者として分類された研究参加者の最大 70% が ALDH2 保有者であることを示しました (X2 p = 0.008)。一方、アルコール非使用者の間では、ALDH2 保有者の野生型と変異型の分布がほぼ等しいことが示されました (表1;補足図1b）は、台湾バイオバンクのデータ（https://taiwanview.twbiobank.org.tw）に基づいて、一般の健康な台湾人集団に見られる同じALDH2遺伝子型分布（ALDH2 Wt 51％）を近似しました。全体として、常習的アルコール使用者は、ALDH2 遺伝子型に関係なく男性である可能性が高く、ALDH2 Wt グループでは高血圧の有病率が高いことが示されました。常習的アルコール使用者（Alc+）は、ALDH2遺伝子型に関係なく（両方ともp < 0.05）（表1および図1a）、常習的アルコール使用者（Alc+）に関係なく、それぞれの非アルコール使用者（Alc−）と比較して、より長いQRS期間およびQTcを示しました。）ALDH2 Vtを保有する患者は、ALDH2 Wtアルコール使用者（Alc+）と比較して、有意に長いQTcをさらに示しました（図1a）。逆多変量回帰モデルでは、アルコール摂取量が多いほど（調整係数：4.52 [95% CI: 3.14-5.91]、10 g+/日あたり、p < 0.001）、ALDH2 Vt（調整係数：7.67 [95%]）が示されました。 CI：2.15–13.18]、p = 0.003）、女性、性別、高血圧の既往、冠動脈疾患（CAD）、および糖尿病は独立してQTc延長と関連していました（図1b）。注目すべきことに、ALDH2 Vt患者は、1日あたりのアルコール摂取量が多い場合（調整された相互作用：0.017）、ALDH2 Wt参加者（r = 0.31）と比較して、より高い用量依存性のQTc延長勾配（r = 0.58）を示しました（図1c））。

ALDH2 Vt アルコール使用者は、非アルコール使用者 (Alc-) および ALDH2 Wt アルコール使用者と比較して、有意に長い QT 間隔 (QTc として RR 間隔に補正) を示しました (Alc-、Alc+ ALDH2 Wt、および Alc+ ALDH2 で 430.1 対 422.4 対 415.6 ミリ秒)それぞれVt）（a）。箱ひげ図は 25 パーセントと 75 パーセントの四分位を表し、線は中央値を表し、ひげは 10% (下位) と 90% (上位) を表します。 * は、各遺伝子型グループ (ALDH Wt または ALDH Vt) 内で Alc- と比較した Alc+ の p < 0.05 を示します。現在の研究における臨床共変量と QTc 間隔の間の関連性を調査する逆方向段階的多変量回帰モデル (b)。 ALDH2 Wt (青) と比較して、ALDH2 Vt (ピンク) を保有する被験者では、1 日のアルコール摂取量が多いほど、QTc の急峻な増加と関連していました (調整後相互作用: 0.017) (c)。 c のバーは、それぞれ QTc の標準偏差とアルコール投与量の標準誤差を表します。陰影領域は 95% 信頼区間領域を表します。各遺伝子型カテゴリー (ALDH Wt または ALDH Vt) 内の Alc+ 対 Alc- について *p < 0.05、**p < 0.001; #p < 0.05 (Alc+、ALDH Vt 対 Alc+、ALDH Wt)

連続追跡 ECG と症状に基づくホルター研究を使用して、研究参加者における VA の臨床頻度と重症度を等級付けしました。 5 年間の追跡期間中に、VA を有する 17 人の研究参加者 (約 7%) が特定されました。参加者の非アルコール使用者では何も検出されなかったが、ALDH2 Wt の常習的アルコール使用者では 6 名 (4.4%) が検出され、ALDH2 Vt を保有する常習的アルコール使用者は重篤な VA を発症するリスクがほぼ 4 倍高いことが示された (n = 11) 、18.6%) (X2 p < 0.001)。 VA の予測因子を調べるために使用される多変量ロジスティック回帰モデルが表示されます (表 2)。 CADの既知の病歴とは別に、ALDH2 Vtを保有する個人は、VAエピソードを発症するリスクが4倍高かった（調整後オッズ比：4.46、95％CI：1.50～13.23、ALDH2 Wtは参照として）。アルコール摂取量が多いほど、重大なVAのリスクが高いことと独立して関連しており（調整後オッズ比：1.41、95％CI：1.13～1.74、10g/日増分あたり；表2）、リスクはALDH2 Vtでより顕著であった。キャリア (調整された相互作用: 0.038); (表2)。 ALDH2 Vt (rs671) の存在は、VA 発症に関して CAD 病歴に影響を与えませんでした (調整された相互作用: 0.30)。最適なカットポイント推定にヨーデン指数を使用した場合、ALDH2 Vt および ALDH2 Wt の研究参加者における有意な VA の 1 日あたりのエタノール摂取閾値は、9.6 g/日 (0.7 ドリンク/日) および 14.1 g/日 (1.0 ドリンク/日) でした。）、それぞれ。

実験プロトコルを示します(図2a)。通常および4％EtOH流動食を7週間与えた野生型（Wt）およびALDH2 * 2 KIマウスの血中アルコール濃度（BAC）を測定しました（補足図2）。 4％アルコール食で7週間治療したWtマウスとALDH2 * 2 KIマウスは両方とも、アルコール食を与えなかったグループと比較して、心臓壁の厚さと心臓サイズの全体的な形態のわずかな増加を示しました（図2b）。 4％ EtOH 処理 Wt マウスおよび他のグループと比較して、4％ EtOH 処理 ALDH2 * 2 KI マウスでは、より広範な心筋間質線維症が観察されました（図 2c、d）。 4％ EtOHを与えられたALDH2 * 2 KIマウスも、4％ EtOHで処理されたWtマウスおよび他のグループと比較して、心臓重量/体重（HW / BW）比の有意な増加を示しました（図2d）。 BAC は 0.011 ± 0.001 vol% (2.120 ± 0.281 mM)、0.057 ± 0.007 vol% (9.443 ± 1.102 mM)、0.013 ± 0.002 vol% (2.098 ± 0.270 mM)、および 0.068 ± 0.007 でした。体積% (11.58 ± 1.171 mM ）それぞれ、Wt/通常食、Wt/4％EtOH食、ALDH2*2 KI/通常食、およびALDH2*2 KI/4％EtOH食マウスグループの場合（補足図2）。注目すべきことに、4% EtOH で治療した ALDH2*2 KI マウスの心電図表現型は、4% EtOH で治療した Wt マウスや他のグループと比較して、QT 間隔 (QT および QTc) の顕著な延長と VA の自然発生を示すヒトの表現型を再現しました。 (7 匹中 2 匹のマウス、他のマウスグループでは 0 匹、図 2e-g、j)。より高いBACレベル（相互作用：0.035）では、4％EtOHで処理したWtマウスと比較して、4％EtOHで処理したALDH2 * 2 KIマウスのより高いQTc延長勾配について同様の傾向が観察されました（相互作用：0.035）（図2k）。

4% Alc 食餌で 7 週間治療した後の生後 4 か月のホモ接合性 ALDH2*2 KI マウス (C57BL/6、雄) (a)。 EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスでは、保存されているがわずかに高い心筋量とLV壁厚を示す、さまざまなグループのマウス心臓の代表的な肉眼的形態および断面における病理関連所見（b）。心臓切片のマッソントリクローム (MT) 染色による組織学的分析 (H&E) (c)。マウスの体重に指数付けされた心臓重量は、それぞれの通常の食餌対照群（d）と比較して、4% EtOH 処置マウス群（左）、特に ALDH2*2 KI マウスでわずかではあるが有意な増加を明らかにしました。心筋層（水色染色）内の著しく広範な線維症（黒い矢印）も、EtOHで処理したALDH2 * 2 KIマウス（右）（d）で観察されました。マウスモデルにおける体表面心電図 (ECG) の図。 4% EtOH で処理した ALDH2*2 KI マウスは、5 分間の連続 ECG 記録中に、他のグループと比較して、より延長された QRS 持続時間、QT 間隔 (e)、および頻繁な VPC (黒矢印) (f) の自発的発症という心電図表現型を示しました。平均すると、表面ECG（g-j）によると、EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスのQRSおよびQTcは、通常食のWtマウスと比較して16％および23.6％の増加を示しました（両方p <0.05）。より高いBACレベル（相互作用：0.035）では、4％EtOHで処理したWtマウス（青）と比較して、4％EtOHで処理したALDH2 * 2 KIマウス（ピンク）のより高いQTc延長勾配が観察されました（図2k）。陰影領域は 95% 信頼区間領域を表します。エラーバーは標準誤差を表します。各遺伝子型グループ (ALDH2*2 KI または Wt) 内の任意の 4% EtOH と通常の食餌対照について *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001; 4% EtOH ALDH2*2 KI 対 4% EtOH Wt. の #p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001

次に、ギャップ結合タンパク質、Cx43、および心室脱分極/再分極に関与するいくつかの重要なイオンチャネル/トランスポーターを調べました。 Cx43抗体による心筋組織の二重染色により、通常食のWtマウスと比較して、4% EtOH処理WtマウスではCx43が上方制御されていることが明らかになった(図3a、b)。対照的に、Cx43は、EtOH処理Wtマウスと比較して、EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスでは有意に下方制御されました（36.6％減少、p = 0.006。図3b）。 EtOH 処理した両方のマウスの心筋細胞における Cx43 分布が変化しました。通常食のWtマウスではCx43は主に挿入された椎間板に限定されていたが、両方のEtOH処理マウス群では心筋細胞の側縁でより高い比率のCx43標識が観察された。これらの所見は、EtOH 処理した Wt マウスと ALDH2*2 KI マウスの両方で、それぞれの通常の食餌対照群と比較して Cx43 側性化が強化されていることを示し、EtOH 処理された ALDH2*2 KI マウスは EtOH マウスの Cx43 側性化と比較してより顕著な Cx43 側性化を示しました。処理Wtマウス（EtOH処理WtおよびALDH2 * 2 KIマウスグループ対通常食Wtマウス群ではそれぞれ52.8％および67.2％増加、両方ともp < 0.001）（図3a、c）。

WGA および Cx43 の心筋二重染色の免疫共焦点顕微鏡検査では、EtOH 処理された ALDH2*2 KI マウスでは、EtOH 処理された Wt マウスおよび通常の食餌と比較して、総 Cx43 発現領域 (総心筋面積補正の有無にかかわらず) が大幅に減少していることが示されました。 ALDH2 * 2 KI マウスグループ。細胞質 Cx43 染色の顕著な増加 (白い矢印) (a、b)。他の2つの通常の食餌対照群（a、c）と比較して、心筋細胞外側境界上のCx43再分布の顕著な増加率が両方のEtOH処理マウスグループで観察され、EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスはより顕著な再分布を示しました。 EtOH処理WtマウスよりもCx43の側方化が増加。各グループについて、13 ～ 15 枚の画像を分析しました (各グループ 3 匹のマウス) (×40、800 ピクセル)。エラーバーは標準誤差を表します。各遺伝子型グループ (ALDH2*2 KI または Wt) 内の任意の 4% EtOH と通常の食餌対照について *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001; 4% EtOH ALDH2*2 KI 対 4% EtOH Wt. の #p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001

免疫蛍光顕微鏡による、異なるマウスグループ間のさまざまなイオンチャネルタンパク質発現の形態学的分析を補足図3に示します。心室心筋細胞は、Nav1.5（緑色）、Cav1.2（緑色）、Cav1.3（緑色）、 Kv1.4 (緑)、Kv4.2 (緑)、Kv4.3 (緑)、および WGA (赤) と DAPI 染色 (青)。簡単に言うと、免疫蛍光顕微鏡検査により、通常食の Wt マウスと比較して、EtOH 処理マウスの心筋細胞は両方とも形態学的変化とイオンチャネルのリモデリング、および異常な構築的な心筋細胞の横紋パターンが示され、これは ALDH2*2 KI マウスでより顕著であったことが示されました。これらには、Nav1.5 の組織化されていない染色 (白い矢じり)、Kv1.4 の染色の弱まりおよび縞模様の消失 (白い矢じりとアスタリスクで表示)、Kv4.2 の不規則な凝集と染色の弱め (白い矢頭と星印で表示)、強調された染色が含まれる場合があります。 Kv4.3 (白い矢頭) の染色は、Cav1.2 (白い矢頭) の凝集を変化させましたが、Cav1.2 と Cav1.3 の両方を強調しました。

タンパク質発現を定量するために定量的ウェスタンブロット実験を実行しました（図4a〜q）。全組織標本のウェスタンブロッティングにより、EtOH 処理した Wt マウスと ALDH2*2 KI マウスの両方の心筋において TGF-β1 とコラーゲン 1 が上方制御されていることが示されました。再び、TGF-β1とコラーゲン-1は、EtOH処理されたALDH2 * 2 KIマウスの心臓でより顕著に発現されました（図4b、c）。 Cx43総タンパク質発現は、EtOH処理Wtマウスおよび他のグループと比較して、EtOH処理ALDH2 * 2 KIで有意に下方制御されました（すべてp <0.05）（図4d）。対照的に、EtOH で治療した Wt マウスにおける Cx43 総タンパク質発現は、通常の食餌で治療した Wt マウスと比較して上方制御されました。心室脱分極および再分極に関与するイオンチャネル発現レベルは、EtOH 処理 Wt マウスおよび ALDH2*2 KI マウスの両方で、それぞれの通常の食餌対照群と比較してわずかに上方制御された Nav1.5 発現の総発現に反映されました (p = それぞれ 0.034 と 0.028) (図 4e)。通常食の ALDH2*2 KI 対照マウス群と比較して、EtOH 処理 ALDH2*2 KI マウスでは Kv1.4 と Kv4.2 の両方が有意に下方制御され (それぞれ p = 0.029 および 0.039)、Kv4.2 発現が有意に低下しました。 EtOH 処理 Wt マウスと比較して、EtOH 処理 ALDH2*2 KI マウスで観察されました。これらの違いは、EtOH処理Wtマウスと通常食のWtマウスでは有意ではありませんでした（p = 0.71および0.93）（図4f、g）。 Kv4.3は、EtOH処理Wtマウスおよび他のグループと比較して、EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスにおいて実質的に上方制御された(図4h)。 L型Cav1.3は、通常食のWtマウスグループと比較してEtOH処理Wtマウスで有意に上方制御されましたが（p = 0.044）、Cav1.2についてはグループ間で有意差は見つかりませんでした（図4i、j）。ナトリウム-カルシウム交換体（NCX）とCaMKII（総発現およびそのリン酸化/酸化型）は両方とも、遺伝子型に関係なく、それぞれの通常食対照群と比較して、EtOH処理群で上方制御され、EtOH中で最も顕著に上方制御されたタンパク質はCaMKIIでした。 -処理されたALDH2 * 2 KIマウス（補足図4）。

心臓組織 TGF-β1/コラーゲン-1、Cx43 (トータルフォーム)、およびさまざまなイオンチャネルタンパク質 (Nav1.5、Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、Cav1.2、および Cav1 を含む) の濃度測定分析.3) ウェスタンブロッティングによる 4 つのマウスグループ (a ～ q)。通常食のWtマウスと比較して、EtOH処理ALDH2*2 KIマウスは、総Cx43が40.4%減少、Kv1.4が74.3%減少、Kv4.2が67.2%減少した(d、f、g)。。通常食または 4% EtOH 食を与えた、ALDH2 が明確に機能するマウスにおける変化の細胞内分布を決定するために、イオンチャネル発現レベルの細胞質および膜画分 (k-q) を個別に調べました。エラーバーは標準誤差を表します。各遺伝子型グループ (ALDH2*2 KI または Wt) 内の任意の 4% EtOH と通常の食餌対照について *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。 4% EtOH ALDH2*2 KI 対 4% EtOH Wt. の #p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001

イオンチャネルの膜画分は依然として電気インパルスと活動電位発生の基本的な機能要素であるため、細胞質画分のレベルとは別に、膜画分の心筋タンパク質発現レベルをさらに調べました（図4k-q）。我々は、EtOH処理マウスにおいて、独特に調節されたNav1.5発現を観察した。筋鞘の Nav1.5 は、EtOH 処理 Wt マウスと比較して、EtOH 処理 ALDH2*2 KI マウスで顕著に下方制御されました (p < 0.001)。対照的に、EtOH処理は、通常食のWtマウスと比較して、Wtマウスにおいて筋鞘Nav1.5の上方制御をもたらした(p=0.008)(図4l)。筋鞘Kv1.4とKv4.2は両方とも、それぞれのEtOH処理Wtマウス群と比較した場合、EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスで顕著な下方制御を示しました（両方ともそれぞれp <0.05）（図4m、n）。逆に、EtOH処理したALDH2 * 2 KIマウスの膜性Kv4.3は、EtOH処理したWtマウスおよび他のグループと比較して有意に上方制御されました（図4o）。膜画分におけるCav1.2およびCav1.3のL型カルシウムチャネルは、通常食のWt対照マウスと比較して、EtOH処理Wtマウスにおいて有意に上方制御されていたが、これらの差異はALDH2*2 KIマウス群では観察されなかった。最後に、遺伝子型に関係なく、それぞれの通常の食餌対照と比較して、両方のEtOH処理マウスグループで細胞質Cav1.2ではなく細胞質Cav1.3の有意な上方制御が観察されました（図4p、q）。

WT マウスと ALDH2*2 KI マウスの両方の心臓の電気伝播パターンに対するアルコールの影響を評価するために、活動電位持続時間 (APD) と伝導速度 (CV) の動的変化を分析しました。 300msのペーシングサイクル長（PCL）での光学的記録を介して評価された左心室心外膜表面の膜電位が示されています（図5a）。平均APD70は、遺伝子型に関係なく、EtOH処理マウスの通常の食餌対照群と比較して一貫して長く、全体的に有意に高いAPD70がEtOH処理Wtマウスと比較してEtOH処理ALDH2*2 KIマウスで観察されました(図5b)。 200 ミリ秒の PCL では、4 つの異なるグループの CV 間に有意差はありませんでした。通常食の Wt マウスと比較して EtOH 処理マウスでは CV が大幅に増加したにもかかわらず、PCL 250 および 300 ms では、通常食の ALDH2*2 KI マウスと比較して EtOH 処理マウスでは CV が大幅に減少していることが観察されました。 EtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスはさらに、250および300msのPCLでEtOH処理Wtマウスと比較して有意に低いCVを示しました（図5c、d）。これらの結果は、EtOH で治療した ALDH2*2 KI マウスは、PCL が高くなると APD が大幅に延長され、CV が低下することを示しました。

a 300 ms PCL での光学活動電位。 b 70% 再分極時の APD。 c 300 ms PCL での心室内の等時線マップとしての電気伝播の例。 d 異なる PCL での CV。各グループの n = 6。誤差範囲はSDです。 p 値は、GraphPad Prism 8.0 を使用して複数の t 検定を使用して計算されました。 APD活動電位持続時間、CV伝導速度、PCLペーシングサイクル長。 e EtOH処理されたALDH2 * 2 KIマウスの悪性VAの例からのVA誘発中に、同時のECG記録と心室光学マッピングが実行されました。 EtOH処理されたWtマウスは、わずかな波の中断を伴うVAのエピソードを1回のみ示し、VA中に回転を示すことができませんでした（補足図2、補足動画2）。通常の食事を与えられた Wt および ALDH2*2 KI マウスは、PES 誘導後のスムーズな電気伝播を明らかにしました (補足ムービー 3 および 4)。 f 主要周波数（DF）ポイントと、VA 中の特定の時点での時間領域の光信号に対応する螺旋波のスナップショット。 g 複数の VA ビートと開始部位が示されています（白い矢印）。 h、i 誘発されたVAエピソードと持続時間の定量化。 (各グループの n = 6)。エラーバーは標準偏差を表します。 p値は、GraphPad Prism 8.0を使用した対応のないスチューデントのt検定によって計算されました。 VA 心室不整脈、PES プログラム電気刺激、DF 卓越周波数。

EtOH で処理した ALDH2*2 KI マウスの不整脈に対する感受性を、プログラムされた刺激によってさらにテストしました。 VA 誘導中、PES 後の EtOH 処理 ALDH2*2 KI マウスでは、悪性 VA の高い脆弱性と誘導性の高頻度リエントラント活動が観察されました (EtOH 処理 ALDH2*2 KI では 11 エピソード/6 マウス vs 0 ～ 1)他のグループのエピソード/6 マウス、すべて p < 0.05）（図 5e-i;補足図 5、6）。支配的な周波数マップを使用すると、VA回転の高周波数領域と、複数の乱れたウェーブレットを伴う誘導性蛇行ローターが、VA拍動中に6匹のEtOH処理ALDH2 * 2 KIマウスのうち4匹で観察されましたが、他のグループでは観察されませんでした（図5f、図5f、図5f、図5f、図5f、図5f、 g; 補足図 5、6; 補足ムービー 1)。比較すると、EtOHで処理したWtマウスは1匹だけが誘導性VAで異常な活性化波面を示し（補足図6b、補足動画2）、通常食Wt群または通常食ALDH2 * 2 KI群のいずれのマウスも示さなかった。誘導性VA（補足図6a、c;補足映画3、4）。 EtOHで処理したALDH2 * 2 KIマウスは、EtOHで処理したWtマウスと比較して、VAエピソードの回数および期間が有意に高かった(図5h、i)。これらの結果は、VA エピソードおよび VA 持続時間の増加が、EtOH 処理 ALDH2*2 KI マウスにおける主な不整脈誘発性の特徴を再現することを実証しました。

EtOHで処理したALDH2 * 2 KIマウスのAPDが変化するかどうかを決定するために、パッチクランプ技術を使用して単離された心筋細胞をモニタリングした。心筋細胞を、電流クランプモードで5msの閾値を超える脱分極刺激でペーシングした。 APD (50% および 90% 再分極) は、EtOH 処理 Wt マウスと ALDH2*2 KI マウスの両方の心筋細胞で延長されました。 EtOH 処理したマウスから単離した心筋細胞では、遺伝子型に関係なく、通常の食餌対照群と比較して、APD50 および APD90 で有意に長い APD が記録され、EtOH 処理した ALDH2*2 KI 心筋細胞は、APD50 および APD90 よりも有意に長い APD を示しました。 EtOH処理Wtマウスのもの（すべてp<0.05）（図6a、b）。これは、APD延長も形態学的光学マッピング膜電位に関する我々の発見を裏付けることを示しました（図6a）。心筋細胞の AP アップストローク (Vmax) における主な脱分極電流、機能不全の Nav1.5 は、Na+ 流入を減少させ、インパルス伝播を遅くし、伝導不均一性を引き起こす可能性があります 17,18。本研究では、両方の EtOH 処理マウスの単離心筋細胞の Vmax は、遺伝子型に関係なく、それぞれの通常の食餌コントロールの Vmax と比較して大幅に減少しました (Wt マウスでは 125.9 ± 6.3 対 146.9 ± 9.6 9 mV/s、p = 0.04) ; ALDH2 * 2 KI マウスでは 97.6 ± 8.0 vs. 140.4 ± 13.9 mV/s、p < 0.01)、EtOH 処理した ALDH2 * 2 心筋細胞はさらに、EtOH 処理した Wt マウスよりも有意に低い Vmax を示しました (p < 0.01)。 0.01、図6c)。すべてのグループの単離された心筋細胞の静止膜電位と活動電位振幅の間に有意差はありませんでした（図6d）。

異なるマウス群間の50％および90％の再分極におけるAPD（a、b）、Vmax（c）、静止膜電位（RMP）、および活動電位振幅（APA）dの重ね合わせ記録の比較。 Vmax は、EtOH 処理および通常食の ALDH2*2 KI マウスでそれぞれ 97.6 ± 8.0 対 140.4 ± 13.9 mV/s でした。 EtOH処理マウスと通常食のWtマウスでは、それぞれ125.9±6.3対146.9±9.69mV/sであった。各遺伝子型グループ (ALDH2*2 KI または Wt) 内の任意の 4% EtOH と通常の食餌対照について *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001; 4% EtOH ALDH2*2 KI 対 4% EtOH Wt. の #p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001 各グループの n = 8 個の独立したセル。エラーバーは標準誤差を表します。

ALDH2変異の有無にかかわらず、アルコール処理マウス心筋細胞におけるVmax活動電位の低下の根底にあるメカニズムを解明するために、異なるグループ間で心筋細胞のナトリウム電流（INa）を比較しました（図7a〜d）。 INaは、-80mVの保持電位から5mV刻みで-80mVから+30mVまでの50msの脱分極ステップによって誘発された。代表的なトレースおよび電流電圧関係は、両方の EtOH 処理マウスグループから分離された心筋細胞の INa が、それぞれの通常の食餌対照グループの INa と比較して、特に EtOH 処理マウスに由来する心筋細胞で顕著に減少していることを示しました (-54.28 ± 5.69)。 Wt マウスの場合、-45 mV で -66.87 ± 8.09 pA/pF、p < 0.05; ALDH2*2 KI マウスの場合、-45 mV で -32.23 ± 4.42 対 -66.50 ± 7.93 pA/pF、p < 0.001) (図.7b–d)。 4% EtOH で処理した ALDH2*2 KI マウスにおける影響を受けた INa 動態を、INa 不活化曲線を使用して分析しました。電圧依存性ＩＮａの不活性化を調べるために、異なる電圧レベルのコンディショニングプレパルス（−１２０〜３０ｍＶ）を２００ミリ秒間印加してチャネル不活性化を誘導した。次に、2番目のパルス（-30 mV）を使用して、膜電位を50ミリ秒間脱分極させました（補足図7a）。次に、INaの振幅が最大電流振幅に正規化され（補足図7b）、ボルツマン方程式モデルを使用してトレースがフィッティングされました（補足図7c）。その結果、4% EtOHで治療したALDH2*2 KIマウスの心筋細胞におけるINa不活化曲線は、通常食のALDH2*2 KIマウスまたはEtOHで治療したWtと比較して、より急峻な傾きで実質的に左にシフトし、V0.5が観察されたことが示された。マウス（両方ともそれぞれ p < 0.01）は、INa 動態が多様に影響を受けたことを示しています。ただし、EtOH処理Wtマウスは、通常の食餌Wtマウスと比較して、心筋細胞の不活化曲線にわずかではあるが有意ではない変化を示しただけでした（補足図7d）。一方、INa の不活化からの回復は、典型的なペアパルスプロトコルを使用して測定されました。 -80 mVの保持電位の後、30ミリ秒の2つの同一の-30 mVパルスが各間隔（0〜380ミリ秒）で分離されました（補足図7e）。ペアのパルス間の間隔に対する電流が生成されてプロットされ（補足図7f）、トレースは単一の指数方程式によって当てはめられました（補足図7g）。

INa と ICa は、それぞれ 50 (a) と 400 ms (e) の脱分極ステップを介して誘発され、代表的なトレース (INa と ICa の b、f) および電流-電圧関係は、INa と ICa の密度 (c、g) を示しています。異なるマウスグループ。遺伝子型およびEtOH処理Wtマウスに関係なく、それぞれの通常の食餌対照と比較して、-45 mV（最大電流）での両方のEtOH処理マウスグループの心筋細胞のINa密度が著しく減少しました（d）。 0 mVでは、両方のEtOH処理マウス群の心筋細胞のICa密度は、それぞれの通常食餌対照群と比較した場合、特にALDH2 * 2 KIマウスで有意に低かった(h)。電位依存性のＩＮａ／ＩＣａ不活化曲線および異なるマウス群間の不活化からのＩＮａ／ＩＣａの回復に関する詳細は、補足図でさらに詳しく説明される。誘発された総外向きカリウム電流 (IK) (i)、代表的なトレースおよび電流-電圧関係は、異なるマウスグループ間の一時的な外向きカリウム電流 (Ito) 密度を示しています。 Ito は、ピーク (Ipeak) と定常状態電流 (Iss) の差として定義されました (j)。 Ipeak、Iss、Ito (k) 密度は、両方の EtOH 処理マウスグループの心筋細胞で有意に減少しました。心筋細胞のIpeakおよびIto密度は両方とも、ALDH2*2 KI遺伝子型のそれぞれの通常の食餌対照群と比較して、EtOH処理した場合のみ有意に低かった。これらの比較は、Wt マウスグループでは有意ではありませんでした (l)。各遺伝子型グループ (ALDH2*2 KI または Wt) 内の任意の 4% EtOH と通常の食餌対照について *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001; 4% EtOH ALDH2*2 KI 対 4% EtOH Wt. の #p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001 各グループの n = 10 個の独立したセル。エラーバーは標準誤差を表します。

両方の EtOH 処理グループは、それぞれの通常食対照グループと比較した場合、不活化からの回復曲線において時定数 (τ) が増加し、有意な右シフトを示しました (Wt および ALDH2*2 について p = 0.01 および p < 0.01)。それぞれKIマウスグループ）、AP動態が多様に変化したことを示しています（補足図7h）。全体として、EtOH処理されたALDH2 * 2 KIマウスは、EtOH処理されたWtマウスと比較して、不活化からの回復曲線においてより有意な心筋細胞ナトリウム電流（INa）の減少と回復時定数（τ）の延長を示しました（図7b〜d;補足図）。。 7）。 APDにおけるカルシウム電流（ICa）の役割をさらに調査し、異なるマウスグループの心筋細胞ICaを比較しました（図7e-h）。 ICaは、-40mVの保持電位から2mV刻みで-38mVから+60mVまでの400msの脱分極パルスによって誘発された。両方の EtOH 処理マウスの心筋細胞の ICa 密度は、それぞれの通常の食餌コントロールの ICa 密度と比較して減少しました (Wt マウスの場合、0 mV で -6.72 ± 1.28 対 -8.48 ± 0.5 pA/pF、p < 0.05; -4.41 ± 0.54対 ALDH2 * 2 KI マウスの 0 mV で -7.75 ± 0.55 pA/pF、p < 0.001) (図 7f–h)、やはり EtOH 処理 ALDH2 * 2 KI マウスから単離された心筋細胞が最も多くの結果を示しました。 ICa 密度の顕著な減少。 4%アルコール処理はまた、時間依存性回復曲線を右にシフトさせ、不活化からのICaの回復を遅らせた。電圧依存性 ICa の不活性化を調べるために、さまざまな電圧レベルのコンディショニングプレパルス (-40 ～ 10 mV) を 200 ms 印加して、チャネルの不活性化を誘導しました。次に、2番目のパルス（0 mV）を100ミリ秒間印加して、膜電位を脱分極させました（補足図8a）。次に、ICaの振幅が最大電流振幅に正規化され（補足図8b）、ボルツマン方程式モデルを使用してトレースがフィッティングされました（補足図8c）。すべてのマウスグループの心筋細胞のICa不活化曲線間に有意な変化は観察されませんでした（補足図8d）。一方、ICa の不活化からの回復は、典型的なペアパルスプロトコルを使用して測定されました。 –40 mVの電位を保持した後、0〜85 msの間隔で2つの同一の200 ms長の0 mVパルスを印加しました（補足図8e）。ペアパルス間の間隔に対する電流がプロットされ（補足図8f）、単一の指数方程式を介してトレースがフィッティングされました（補足図8g）。時定数（τ）は、遺伝子型に関係なく、それぞれの通常の食餌対照群と比較して、両方のEtOH処理マウスの心筋細胞で有意に増加しました（τ;両方p <0.01;補足図8h）。これは、ICaの再分極が影響していることを示しています。動態はアルコール処理により著しく乱れた。

アルコール処理された Wt マウスおよび ALDH2*2 KI マウスの心筋細胞における一時的な外向きカリウム電流（Ito）と APD 延長との関連を明らかにするために、電圧固定モードで異なるグループの心筋細胞の Ito を比較しました（図 7i- l）。総外向きカリウム電流 (IK) は、-40 mV までの 5 ms の脱分極、続いて -70 mV の保持電位から 5 mV ずつ増加する、-30 mV から +80 mV までの 400 ms の脱分極パルスを介して誘発されました。。 Itoは、ピーク電流（Ipeak）と定常状態電流（Iss）の差として定義されました（図7j）。電流と電圧の関係は、EtOH処理WtマウスとALDH2 * 2 KIマウスの両方の心筋細胞におけるIpeak、Iss、およびItoが、通常食のWtマウスと比較して有意に低いことを示しました（図7k）。 +80 mV では、EtOH 処理マウスの心筋細胞の Ipeak 密度と Ito 密度は両方とも、ALDH2*2 KI 遺伝子型の通常食対照群の心筋細胞密度と比較して有意に低かった (それぞれ 23% と 32% 減少) が、有意差はありませんでした。 Wt 遺伝子型の EtOH 処理マウス群と通常食マウス群の間 (Ipeak および Ito: EtOH 処理 KI 対通常食 KI では 27.68 ± 3.18 対 35.87 ± 2.26 pA/pF、および 10.77 ± 1.77 対 15.83 ± 1.33 pA/pF) 、両方とも p < 0.05; EtOH 処理 Wt 対通常食 Wt の場合、31.79 ± 3.11 対 47.52 ± 7.25 pA/pF および 12.45 ± 1.81 対 17.87 ± 3.33 pA/pF、それぞれ p = 0.08 および 0.15;図 7l ）。両方のEtOH処理マウスからの心筋細胞のIss密度は、遺伝子型に関係なく、それぞれの通常の食餌対照のそれに匹敵していた(図7l)。心筋細胞のItoの不活化（補足図9a〜d）も回復（補足図9e〜h）も、異なるグループ間で差異は見出されませんでした。内向き整流器カリウム電流（IK1）は4つのグループすべてで同等であり、RMPがすべてのグループで同様であるという発見を裏付けています（補足図10）。総合すると、ヒトの VA を模倣した我々の光学マッピングとシミュレーション、および単細胞活動電位のパッチクランプ測定の結果は、ALDH2*2 KI 遺伝子型が、光から光への変換に従事するヒトの VA に関連する特徴的な成分であることを示しました。適度なアルコール摂取。

ALDH2*2 変異体を保有するヒト被験者では、アルコールの毒性影響の閾値が大幅に低いことが提案されています 19。アルコールの安全閾値の低下は健康に影響を及ぼし、世界の東アジア人口のほぼ 35% ～ 45% を占める推定 5 億 4,000 万人の人口に臨床的影響を及ぼします 10、12、13、14。今回我々は、軽度から中度のアルコール使用者（用量中央値：12.7［IQR：6.3～32.8］g/日、または、標準飲料の中央値: 1 日あたり 0.9 [IQR: 0.5 ～ 2.3] ドリンク、米国の標準飲料 1 杯 = 純アルコール 14 g)、ALDH2 野生型遺伝子型を持つ常習的アルコール使用者とアルコール非使用者との比較、ALDH2 変異遺伝子型を持つ人々。 4. 4%アルコール食を7週間投与したALDH2*2 KIマウスを用いて、VA脆弱性を伴うQT延長のヒト心電図表現型を再現しました。 VA脆弱性は、アルコールを与えられた生きたALDH2 * 2 KIマウスでのみ観察され、プログラムされた電気刺激を介して、アルコールを与えられたALDH2 * 2 KIマウスに由来するex vivoランゲンドルフ灌流心臓に誘発されました。低アルコールを与えたALDH2*2 KIマウスにおけるVAの誘導は、脱分極に影響を与える特有のCx43および筋鞘Nav1.5リモデリングとともに、病理学的に誘発された心筋コラーゲン沈着に依存しているようだ。単細胞パッチクランプ心筋細胞から観察される再分極イオン機構の障害（Ito密度低下など）と異常なCaMKIIシグナル伝達は、アルコール給餌ALDH2*2 KIマウスにおけるVA感受性の増加とともにAPDの長期化をさらに悪化させた。

急性および重度のアルコールへの曝露は、不整脈を引き起こすいくつかの病理学的シグナル伝達カスケードを引き起こすことが示されています5、20、21。慢性的な大量飲酒は生命を脅かす不整脈を引き起こすことが示されているが、ALDH2酵素欠損がALDH2欠損のない人に比べて安全閾値が低く、好ましくない電気生理学的特徴に寄与しているかどうかは依然として不明である。本研究の一環として実施された5年間の観察期間に基づいて、毎日のエタノール曝露と臨床的VAの発症リスクとを関連付ける閾値レベルは、1日当たりの標準飲料量1.0g（9.6g/日または0.7g）未満であることが判明した。正常なALDH2ヒト被験者（14.1g/日または1ドリンク/日）と比較した、ALDH2変異体を保有するヒトの摂取量/日）。この発見は、不活性な ALDH2 酵素保有者が軽度から中程度のレベルのアルコール飲料を摂取すると、潜在的に生命を脅かす VA 事象に直面する可能性があることを示唆しています。さらに、不活性型の ALDH2 を保有する個人は、VA 感受性のために非常に不利な結果を経験する可能性が高くなりました。これらの発見に従って、現在の研究は、光学マッピングによるローター形成を伴う高リスクVAエピソード（図5h、i）が、用量である4％エタノールを組み込んだ食餌で治療されたALDH2 * 2 KIマウスでのみ誘発可能であることを示しました。これは、別の研究で報告されている、許容される中程度のアルコール用量の 5% EtOH を組み込んだ食事よりわずかに低い値です 22。我々の以前の研究で顕著な電気生理学的障害を示した6% EtOH食を14週間継続的に与えたWtマウスと比較して、4% EtOH食を14週間連続的に与えたWtマウスは、誘発性のVA16がなく、中程度の心室電気生理学的影響しか示さなかった。注目すべきことに、4% EtOH で処理した Wt マウスにおける BAC 40 ～ 50 mg/dL (8 ～ 12 mM) は、ヒトの中程度の用量 23 およびマウス C57BL/6 実験モデルにおける軽度から中程度のアルコール曝露 24 に相当しました。このアルコール濃度は、アルコール関連の中枢神経への影響に関しては低用量 (2 ～ 20 mM) であるとも考えられました 23。別の研究では、シミュレーションモデルを使用したヒト心室心筋細胞における APD 延長の急性効果は、80 mM という高エタノール濃度でのみ観察されました 25 が、ALDH2*2 由来のマウス心筋細胞における APD 延長は、より低い閾値 12 mM で観察されました。エタノール。

現在の研究の結果は、4% EtOH で処理した Wt マウスにおいて Cx43 が 7 週間上方制御されたことを示しました。しかし、我々は、前回の研究では 14 週間連続 4% EtOH 処理した Wt マウスで Cx43 が有意に下方制御され、本研究では 4% EtOH 処理した ALDH2*2 KI マウスでは 7 週間のみ Cx43 が有意にダウンレギュレートされたことを観察しました。 ALDH2 欠損は、同じ用量のエタノール曝露で Cx43 異常を促進します。私たちの以前の研究で報告されているように、飲用可能な液体の唯一の供給源として 36% アルコールを与えられた野生型 C57BL/6 J マウスでは、Cx43 が上方制御されました 26。それにもかかわらず、EtOH処理したWtマウスグループとALDH2 * 2 KIマウスグループの両方は、Cx43の側方化の強化を示し（図3c）、おそらく非接合ヘミチャネルの形成を促進し、Ca2+ダイナミクスの強化により電流漏れを促進しました27、28。これらの不整脈誘発性のCx43リモデリングの特徴は、間質性線維症の誘発と組み合わされ、細胞間結合をさらに障害し、CVの遅延を引き起こす分散インパルス伝播に部分的に寄与し、不整脈促進効果を伴う再突入を促進しました17、29、30。電気伝導に影響を与える因子（例えば、Vmaxの低下）と関連した中程度のCx43リモデリングも不整脈を引き起こす可能性があります。さらに、より遅いフェーズ0によるNav1.5（またはINa）の下方制御もAPD延長に寄与する可能性があります17、18。したがって、我々は、単離された単細胞心筋細胞のパッチクランプを使用して、EtOH 処理された ALDH2*2 KI マウスの INa をさらに調べました 29。我々の以前の研究では、4% EtOH を 14 週間投与すると、C57BL/6 WT マウスに対して筋鞘 Nav1.5 の減少 (約 30%) や機能不全などの適度な効果が及んだことが示されています 16。比較すると、膜性 Nav1.5 および INa の減少は、4% EtOH で 7 週間処理した EtOH 処理 Wt マウスと比較して、ALDH2*2 KI マウスでより顕著でしたが、EtOH 処理 Wt マウスと ALDH2*2 KI マウスの両方で示されました。我々のパッチクランプ研究では、それぞれの通常の食餌対照と比較して、Vmax が減少し、Na+ 流入が障害され、共通の異常なゲート特性が見られました。さらに、静止膜電位とIK1の両方がVmaxとINaに影響を与える可能性があるため、これらのテストの比較可能な値（図6dおよび補足図10）は、観察されたVmaxの低下とINaの減少がNav1の過剰な下方制御に起因する可能性があることを示しました。 5（EtOH処理ALDH2*2 KIマウスで観察されたように）または内部Nav1.5機能不全。全体として、これらの発見は、EtOH 処理した ALDH2*2 KI マウスにおける Cx43 と Nav1.5 の調節不全が、脱分極中の伝導予備能のより深刻な喪失を引き起こし、それによってリエントラント回路形成と VA の開始に有利な電気生理学的基質を提供することも示唆しています。エピソード。

我々の研究では内向き整流カリウム電流（IK1）が異なるマウス群間で同等であったため、Kvイオンチャネルタンパク質、特にItoは心筋細胞のAPDの決定において極めて重要な役割を果たしている可能性がある29,31。特に、Kv1.4 と Kv4.2 は両方とも、Kv4.2 が主要な心室 Kv イオンチャネルタンパク質として機能するマウスの心室再分極に関与するイオンチャネルとして重要な役割を果たしています 32,33,34。したがって、Kv4.2 発現の下方制御は、Ito,f の低下と APD35 の延長をさらに引き起こしました。本研究では、筋鞘の Kv1.4/Kv4.2 の両方が、それぞれの EtOH 処理 Wt マウスと比較して、EtOH 処理 ALDH2*2 KI マウスで顕著に減少しており、Ito の重大な機能不全と ALDH2 からの再分極プロセスが示されています。酵素欠損が EtOH にさらされると、不整脈の基質形成が促進される可能性があります。対照的に、他の研究で報告されているように、マウスでわずかに機能している Ito,f チャネルである Kv4.3 は、EtOH 処理した ALDH2*2 KI マウスでは明確に調節されており、抑制された Kv4.2 または Ito の減少を補っているようです 33 、36。上方制御された Kv4.3 は、特定の病的な心臓状態における心室の電気的/構造リモデリングを逆転させようとする、過剰活性化 CaMKII および下流シグナル伝達による電気分散誘発致死的 VA の結果に対抗することも知られています 37,38,39。それにもかかわらず、ALDH2*2 KI マウスのアルコール処理によって引き起こされる CaMKII 過剰発現による Ca2+ 恒常性の欠陥は、AP 延長にさらに寄与する内向きの脱分極電流を生成することによって、CaMKII 依存性の下流シグナル伝達 (例、ナトリウム - カルシウム交換体の活性化) 40 を活性化する可能性があります 41。 42. 蓄積されたアセトアルデヒドが、複数の機構、例えば、RyR2 媒介 Ca2+ リークおよび RyR2 阻害を直接促進することによる細胞内 Ca2+ ホメオスタシスの乱れ、Ca2+ リン酸化の乱れ、または SERCA 媒介の Ca2+ リークなどの複数のメカニズムを通じて、ICa を阻害する可能性があることを示す以前の発見と一致します。 CAMKII の活性化により、刺激時に筋小胞体から放出される Ca2+ の量が制限されます。したがって、我々は、ALDH2*2 KI 条件下でもそのような影響が発生する可能性があり、悪化するのではないかと推測しました 21,43,44,45。より遅く右にシフトしたICa活性化曲線（図7g）は、不活化からのより遅い回復時定数（τ）（補足図8）と相まって、心筋細胞をAP延長しやすくし、それによって不整脈の傾向を増加させる可能性があります。総合して考えると、これらの特徴は、4% EtOH46 で治療した ALDH2*2 KI マウスのプログラム刺激中に、再分極性不整脈原性基質と、より高い VA 脆弱性を伴うローター形成を促進するために、同時に相乗的に作用すると考えられます。これらのメカニズムと電気的摂動が、軽度から中度のアルコールを慢性的に使用するALDH2*2を持つヒト被験者の不整脈に対する感受性増加の根底にある原因であるかどうかを証明するには、今後の研究が必要です。

要約すると、我々の発見は、Wt ALDH2を保有するヒト被験者と一般的なアルコール不耐症ALDH2*2不活性変異体を保有する被験者におけるVAを予防するために必要なアルコール安全性閾値に関する現在の知識ギャップに対処するものである。私たちの知る限り、これは、軽度から中程度の範囲のアルコールレベルに慢性的に曝露されているWt ALDH2およびALDH2*2変異体キャリアの心室電気生理学的特性に関する包括的なデータを提供する最初の研究でもあります。私たちは、ALDH2*2 変異体を保有することで知られるヒト被験者および軽度から中程度のアルコール摂取量において、表現型の APD 延長が VA に関連していることを実証し、対応する低濃度で治療した ALDH2*2 KI マウスを用いた動物研究の結果を完全に裏付けました。アルコールの量。メカニズムの研究により、光学マッピングによるローター形成を伴う心室再突入基質が示されています。分子レベルでは、広範囲のイオンチャネルとコネキシンリモデリングが機能不全の脱分極/再分極電流を駆動し、VAに対する感受性の増加につながることが判明しました（図8）。これらの発見は、ALDH2*2 遺伝子型が、軽度から中度のアルコール摂取量を持つヒトにおける VA の感受性の高い成分であることを示し、低度から中度のアルコール使用によって誘発される致死性 VA のリスクを強調しています。私たちの実験マウスモデルは唯一の食物源として4％アルコール食で治療されており、これは人間のアルコール使用のパターンや頻度とは異なる可能性があるため、現在の研究結果の解釈には注意が必要です。 ALDH2*2 は、5 億 4,000 万人の東アジア人からなる世界の大規模な人口に影響を与えており、その多くは常習的に軽度から中度のアルコールを飲む人であるため、今回の発見は、将来さらに大規模な疫学研究によって確認される可能性があります。 ALDH2*2 バリアント以外のアジアの ALDH2 ミスセンスバリアントは、最近、Human Genome Aggregation Database (gnomAD、https://gnomad.broadinstitute.org/) によって編集されました47。これらの ALDH2 変異体のいくつかは、in vitro でアルコール代謝活性の低下を示しました 47。おそらく、他の民族グループのこのような ALDH2 変異保有者も、軽度から中度のアルコールの使用によって VA イベントに対して脆弱になる可能性があります。同様に、私たちの最近の研究でも、ALDH2 変異体は、軽度から中度のアルコール使用で心房細動を発症し、心房機能が損なわれる傾向があることが示されました 48。したがって、公衆衛生政策立案者にとって、ALDH2欠損症患者の大部分を対象とした安全な飲酒ガイドラインを評価し、策定する必要性が高まっています。 Alda-1 などの ALDH2*2 の小分子酵素活性化因子が発見されています11。予防の観点から、そのような化合物は、頻繁にアルコールを使用するかアルコール依存症である、ALDH2 * 2 変異体を保有する被験者の保護剤として機能する可能性があります。

(1) EtOH を使用しない野生型 (Wt) (左パネル)、(2) EtOH を使用する Wt (中パネル)、および (3) EtOH を使用する ALDH2 バリアント (多型) の条件における心臓電気生理学的特性の変化 (右パネル）。

私たちは、習慣的なアルコール使用に関する構造化されたアンケートを介して、外来診療所から 268 人の研究参加者を前向きに募集しました。 ALDH2 SNP rs671 遺伝子型決定は 260 人の研究参加者で実施され、そのうち 256 人は除外基準に基づいて選択された後、臨床人口統計情報を完了しました（補足図 1a）。私たちは、12 誘導体表面 ECG の結果、人体計測学 (身長、体重、腹囲など)、生化学情報 (脂質プロファイルおよび MDRD 式を使用して eGFR として定義される腎機能を含む)、および背景の病歴 (腎臓の存在を含む) を収集しました。高血圧、2 型糖尿病、高脂血症の治療、CAD、およびすべての参加者が使用した関連薬剤のデータ。私たちの研究参加者は全員、心不全がなく、緊急の病状もありませんでした。研究参加者全員からインフォームドコンセントを得た。これらの参加者は、アルコール摂取に関して少なくとも5年間追跡調査されました。私たちのアンケートと調査では、彼らのアルコール消費パターンは少なくとも 5 年間安定していることが示されました。 1 日のアルコール摂取量は、消費されたさまざまな種類のアルコール飲料、使用量および使用頻度が自己申告される構造化されたアンケートを使用して推定されました49。簡単に言うと、研究参加者はビール、リキュール、ワイン、濃いワインをどのくらいの頻度で摂取するか、またそれぞれの機会に摂取する量を記入するよう求められました。各参加者の週のアルコール消費量は、各アルコール飲料の摂取頻度とエタノールの正確な用量（量とエタノール濃度から導き出される［ビールの場合は 3.5 ～ 4.5%］）の積を乗じることにより、純アルコールのグラム数で計算されました。各アルコール飲料中のエタノール比重（0.79g/ml）より以下のようになります。

研究参加者は、アルコール非使用者（アルコール飲料を使用しない人、または毎週のアルコール摂取量が 14 g 未満（標準ドリンク 1 杯に相当））と常習的アルコール使用者（アルコール飲料を 1 杯以上摂取する人として定義）に分類されました。標準ドリンク/週）。軽度から中程度のアルコール消費量のみを有するヒト被験者に焦点を当てるために、最初の研究参加者 256 人のうち 3 人（アルコール摂取量 90 g/日以上または 1 日あたり 6.4 杯の飲酒者として分類された人）は除外されました。その結果、常習的な軽度から中度のアルコール使用者196人を含む合計253人の研究参加者が最終分析と追跡調査に参加しました（図S1A）。これらの196人の常習的な軽度から中度のアルコール使用者と57人の非アルコール使用者さらに、ALDH2 遺伝子型に応じて、ALDH2*1 野生型 (Wt) と ALDH2 変異型 (ALDH2 GA または AA 遺伝子型) (ALDH2 Vt) の 2 つのグループに分類されました (表 1)。現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

各研究参加者は、標準化された 12 誘導体表面 ECG 記録を受けました (Page Writer Trim III、Philips、アンドーバー、マサチューセッツ州、米国)。 PR 間隔、QRS 継続時間、および QT 間隔 (RR 間隔: QTc の補正の有無に関係なく) に関するパラメーターが取得され、紙速度を 50 mm/s に設定してソフトウェアによって自動的に分析されるため、正確で信頼性の高い QRSd および QT インデックスが可能になりました。対策。

ベースラインおよび連続 ECG は毎年実施されるか、外来診療所で年に 2 回追跡され、最長 5 年間続きました。さらに、心臓専門医の臨床判断と研究参加者の臨床症状（動悸、めまい、胸部不快感など）または兆候（不整脈の疑いなど）に基づいて、ホルター心電図モニタリング（連続24時間）が計画されました。臨床的 VA は、ベースラインまたは追跡調査 (最長 5 年間) で、1 回の 10 秒間の ECG 記録で 1 回を超える心室性期外収縮、または 1 時間あたり (24 時間の記録で平均) 30 回を超える心室性期外収縮として定義されました。心臓突然死の発生率の上昇と関連していると報告されています50。

ALDH2*2 KI 動物研究は、実験動物の管理と使用に関する施設および国のガイドライン (台湾動物保護法、動物の科学的応用、1998 年) に準拠していました。この研究で使用されたすべての動物（ホモ接合性 ALDH2*2 マウスおよびその野生型同腹子）は C57BL/6 遺伝的背景を有しており、プロトコルは施設委員会によって検討されました（MMH-AS-107-69）。生後 4 か月の野生型雄 C57BL/6 マウスまたはホモ接合性 ALDH2*2 KI マウスを 2 つの食餌グループに割り当てました 16。これらは、(i) 通常の食餌グループ (自由に流動食; ドライミックス #F1259SP Bio-Serv® Advancing Science. Enriching Animals, USA Test with温かい水道水); (ii) 4% EtOH グループ (4% v/v アルコール流動食、ドライミックス #F1697SP、マルトースデキストリン、エタノール、および温かい水道水が補充された Bio-Serv®)。流動食は、7週間連続してマウスがアクセスできる唯一の水分と食物の供給源であり続けた。合計で、我々の研究デザインは 4 つのマウスグループで構成されました: (i) Wt/通常食、(ii) Wt/4% EtOH、(iii) ALDH2*2 KI/通常食、および (iv) ALDH2*2 KI/4 %エタノール。通常食群では、マルトースデキストリンを等カロリーのエタノールに置き換えた。給餌の 1 時間後、すべてのマウスを深い麻酔下で安楽死させ、尾から静脈血を採取して収集しました (0.1 ～ 0.2 ml)。血清サンプルを収集して遠心分離し、血漿を -80 °C で保存しました。 BAC は、EnzyChrom™ エタノールアッセイキット (ECET-100、BioAssay Systems) を使用して測定しました。実験プロトコールは、マッケイ記念病院の治験審査委員会の動物管理使用委員会によって承認されました。マウスは、生理食塩水による経心臓灌流を伴うイソフルラン麻酔によって安楽死させた。マウス研究の概略図を示します (図 1)。

体表面 ECG は、空気と 50:50 の比率で混合した酸素と亜酸化窒素の組み合わせで 1 ～ 2% イソフルラン (FORANE、ABBOTT Laboratories Ltd.、英国) を使用して麻酔下で実行されました。安定化したら、実験マウスは、Biopac モニタリングシステム (Biopac Systems, Inc.、ゴレタ、カリフォルニア州、米国) に接続された電極を使用して詳細な体表面 ECG 検査を受けました (心拍数約 450 ～ 550 拍/分)。体表 ECG は、四肢すべての皮下に挿入された ECG 電極を使用して実行され、連続 ECG 記録が 2 kHz の掃引速度で 10 分間取得されました。マウスの ECG 結果は生データとして保存され、屠殺前のベースライン (16 週齢) と研究のエンドポイント (23 週齢) で記録されました。データは、30 ～ 35 心拍をカバーする市販ソフトウェア (Biopac Student Lab Analysis 4.1.0) を使用して分析されたカスタム 2 MATLAB スクリプトを使用したオフライン分析用に保存されました。 PR 間隔は、P 波の始まりから R 波のピークまで測定されました。 QRS 間隔は、Q 波の始まりから S 波がベースライン点を横切る点まで測定されました。 QT 間隔は、Q 波の始まりから T 波がピークから 90% に低下する点 (T90) まで測定されました。適応心拍数補正 QT 値は、マウス ECG に対するミッチェルの式を次のように修正して導き出しました。

心筋Cx43の形態とリモデリングパターンを分析するために、アルゴン/クリプトンレーザーを備えたLeica TCS SPを使用して、心筋サンプルから免疫標識したCx43を画像化し、共焦点レーザー走査顕微鏡で検査しました。 Nav1.5、Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、Cav1.2、および Cav1.3 を含むさまざまなイオンチャネルタンパク質の形態学的および構造的リモデリングを免疫蛍光顕微鏡で検査しました。マウスの心臓を最初に生理食塩水で灌流した。その後、すべての心室サンプルを OCT 溶液に包埋し、-80 °C で保存しました。凍結組織を 3 µm の切片にスライスし、4% パラホルムアルデヒドで固定し、0.5% Triton X-100 で 30 分間透過処理した後、ブロッキング溶液 (ダルベッコリン酸中の 0.1% ウシ血清アルブミンおよび 0.1% Triton X-100) でブロックしました。緩衝生理食塩水）を1時間。心臓リモデリングの検出のために、小麦胚芽凝集素とコネキシン 43 の二重染色も実行されました。 FITC 結合 WGA (Vector、米国カリフォルニア州バーリンゲーム) を使用して細胞境界を検出しました。抗Ｃｘ４３抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、米国）を使用してＣｘ４３を検出した。ロバ抗ウサギ Cy3 (Chemicon、カリフォルニア、米国) を使用して、免疫標識コネキシン 43 (Cx43) を視覚化しました。

イオンチャネルと WGA の二重標識の場合、Nav1.5 (1:200、ウサギポリクローナル、Alomone Labs)、Cav1.2 (1:100、ウサギポリクローナル、Alomone Labs)、Cav1.3 (1:100、ウサギポリクローナル、Alomone Labs) Labs)、Kv1.4 (1:100、ウサギポリクローン、Alomone Labs)、Kv4.2 (1:100、ウサギポリクローン、Alomone Labs)、および Kv4.3 (1:100、ウサギポリクローン、Alomone Labs) 抗体を使用しました。 4℃で一晩インキュベートした後、ヤギ抗ウサギ Alexa 488 (1:400、Invitrogen) で標識しました。そして翌日、Alexa 594 (1:500、Invitrogen) との WGA コンジュゲートを 25 °C で 2 時間インキュベートしました。すべてのセクションは、DAPI を含むアンチフェードでマウントされました。

画像は、Cx4.3/WGA 染色用に 40 倍の対物レンズとズーム 1.0 を使用して収集されました。コンピュータ設定のイオンチャネル/WGA染色用のズーム4.0。記録された各画像は 1024 × 1024 ピクセルで構成されます。 4 つの連続する光学セクションの投影図をセクションの中央で 0.25 または 1 μm 間隔で撮影し、分析のために記録しました。すべての画像は ImageJ または Adobe Photoshop CS6 ソフトウェアで処理されました。

Cx43 の画像解析は、心筋 Cx43 分布の解析のために QWIN 画像解析ソフトウェア (Leica) を使用して行われ、以下の情報と評価が各マウスグループから得られました。以下の情報と評価が得られました。 ii）心筋細胞面積あたりの免疫標識Cx43の総面積、および（iii）個々の心筋細胞における免疫標識Cx43タンパク質の総面積で割った側縁に沿った免疫標識Cx43面積の割合。

Cx43 (Cx43 の全アイソフォーム、リン酸化 [機能的] [p-Cx43]、および非リン酸化 [np-Cx43] アイソフォームを含む)、カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (適切な抗体を使用して、CaMKII (総 [ox-CaMKII] 型と酸化型 [ox-CaMKII] の両方)、イオンチャネル、および活動電位生成に関与する関連イオン輸送体タンパク質の解析を実施しました。電気生理学的特性に関連する主要なイオンチャネルまたはタンパク質の細胞質および膜画分がさらにテストされました。液体窒素から採取した左心室自由壁の組織サンプル（全組織標本として）を、ホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（Roche）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Roche）を含む1% NP40細胞溶解緩衝液を使用して溶解し、超音波処理によりホモジナイズしました。。左心室自由壁の細胞質および膜タンパク質は、CNM コンパートメントタンパク質抽出キット (K3012010、BioChain、米国) を使用して調製しました。総タンパク質は、Lowry の方法 (DC Protein Assay Kit、Bio-Rad、米国) を使用して推定されました。

SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、5% スタッキングゲルと 10 ～ 12% 分離ゲルからなるミニゲルを使用して実行されました。次に、各組織タンパク質 30 ～ 40 μg、細胞質画分 100 μg、または膜画分 50 μg をサンプル緩衝液 (2.5% 2-メルカプトエタノールおよび 1% ブロモフェノールブルー) と混合して、最終体積を 20 ～ 30 μg にしました。 μL を各レーンにロードし、電気泳動 (スタッキングゲルでの泳動では 80 V、分離ゲルでの泳動では 120 V、定電圧) を行い、移送しました (80 V、氷上で 150 分間定電圧)。 PVDF 膜 (Perkin Elmer、米国) は、コラーゲン 1 (1:1000、マウスモノクローナル、Sigma)、Cx43 (1:250、マウスモノクローナル、BD Biosciences)、Cx43 (1:1000、ウサギポリクローン) に特異的な一次抗体を使用して検出されました。、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、Ｃｘ４３のリン酸化（機能的）（ｐ−Ｃｘ４３）形態および非リン酸化（ｎｐ−Ｃｘ４３［Ｃｘ４３−Ｐ０］）アイソフォームを認識する。 TGF-β 1 (1:500、マウスモノクローナル、Santa Cruz)、Nav1.5 (1:200、ウサギポリクローナルクローン、Alomone Labs)、Kv1.4 (1:200、ウサギポリクローナルクローン、Alomone Labs)、Kv4。 2 (1:200、ウサギポリクローン、Alomone Labs)、Kv4.3 (1:200、ウサギポリクローン、Alomone Labs)、Cav1.2 (1:250、ウサギポリクローン、Alomone Labs)、Cav1.3 (1:250) 、マウスモノクローナル、Gene Tex)、NCX1 (1:1000、マウスモノクローナル、Gene Tex)、p (Thr286)- カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) (1:2000、マウスモノクローナル、Gene Tex)、ox -CaMKII (1:1000、ウサギポリクローナルクローン、Gene Tex)、および総 CaMKII (1:1000、ウサギポリクローナルクローン、Gene Tex) を 4℃で一晩。ブロットを二次抗体とともに室温で 1 時間さらにインキュベートしました。免疫反応性は、ECL 溶液 (Perkin Elmer、米国) を使用して視覚化して画像を作成しました。発現レベルを正規化するために、ブロットを剥がし、内部対照として使用した抗 GAPDH 抗体 (1:50,000、マウスモノクローナル、Sigma-Aldrich) とともにインキュベートしました。膜タンパク質の発現レベルを正規化するために、膜マーカータンパク質 Na+K+-ATPase (1:1000、ウサギポリクローナル、Cell Signaling) を内部対照として使用しました。ウェスタンブロッティングでは、MultiGel-21 画像システム (TOPBIO CO. 台湾) を使用してブロットに対して定量的濃度測定スキャンと分析を実行し、画像と分析用の Gel-Pro ソフトウェアを開発しました。これらの分析のトリミングされていないオリジナルバージョンは、補足図で入手できます。 11〜15。

ＶＡのエクスビボマッピングのために、マウスを麻酔下で安楽死させた。心臓を直ちに開胸術によって切除し、温かい酸素を添加したタイロード液（pH 7.4; 95% O2、5% CO2、36 ～ 38 °C）でランゲンドルフ灌流しました。 1 つの Ag/AgCl 電極を心尖部近くの LV に配置し、もう 1 つを右心室の表面に取り付けて ECG を記録しました。単離したマウスの心臓を電位感受性色素 (Di-4-ANEPPS、100 μmol/L、ThermoFisher Scientific、Waltham、MA、USA) で染色し、10 分間の安定化後の光学膜電位を記録しました。ブレビスタチン (5 ～ 10 μmol、TOCRIS、ブリストル、英国) をタイロード溶液に直接添加して、モーションアーティファクトを軽減しました。 Di-4-ANEPPS を活性化するために、心臓を波長 505 ± 20 nm の緑色発光ダイオードで均一に照射しました。蛍光画像は、CMOS カメラ (1000 フレーム/秒、SciMedia、米国) を使用して 600 nm ロングパスフィルターを通してキャプチャされました。ペーシング誘発性 VA に対する脆弱性は、各マウスの左心室の興奮閾値の 2 倍であるバーストペーシング 10 サイクル (20 Hz、10 秒) によるプログラムされた電気刺激によって評価されました。マップされた領域の各位置で誘発された VA 中の光信号の主周波数が記録され、高速フーリエ変換を使用して計算されました。すべてのピクセルの主周波数を使用して、主周波数マップが構築されました。

全細胞パッチクランプ技術を使用して、Axon CNS 700 B アンプ (Molecular Devices、カリフォルニア州、米国)、Digidata 1550 A データ収集システム、および pClamp ソフトウェア (バージョン 10、Molecular Devices) を使用して膜電位とイオン電流を記録しました。電流クランプモードと電圧クランプモード。左心室筋細胞は、ランゲンドルフ心臓灌流技術を使用して酵素的に単離されました。マウスの心臓をクレブス緩衝液 (120 mM NaCl、12 mM グルコース、25 NaHCO3、1.2 KH2PO4、1.2 MgSO4、および 5.4 KCl) で逆行的に灌流しました。平衡化後、クレブス緩衝液中の 0.4 mg/mL コラゲナーゼ (II 型、ワーシントン) を 1 分間灌流しました。２０分後、マウスの心臓を小片に切断し、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｉｂｃｏ）中で濾過した。

静止細胞を、137、5.4、1.8、1.1、6、22、および0.33 mMのNaCl、KClを含む浴溶液中の倒立顕微鏡(Eclipse Ti-U、Nikon Corporation、日本)のステージに取り付けられたチャンバー内に置いた。、CaCl2、MgCl2、HEPES、グルコース、NaH2PO4。 NaOHを使用してpHを7.4に調整した。 INa の検出を目的とした実験では、N-メチル-D-グルカミン (91 mM) を等濃度の NaCl の代わりに使用しました。特定の実験では、Cs+ (2 mM) と Co2+ (1 mM) を添加して、それぞれカリウムとカルシウムの流れをブロックしました。加熱研磨したガラス電極（ピペットを通して内部溶液を充填したときの先端抵抗は約 2 MΩ）を、ガラス微小電極プーラー（PC-10、Narishige International Inc.、East）を使用してホウケイ酸ガラスキャピラリー（外径 1.5 mm）から調製しました。米国ニューヨーク州メドウ）。内部溶液には、120 mM KCl、5 mM MgCl2、5 mM MgATP、10 mM HEPES、および 15 mM EGTA が含まれていました。室温でＫＯＨを使用してｐＨを７．２に調整した。 INa および ICa の測定では、Cs+ とテトラエチルアンモニウム (TEA) をピペット溶液に添加しました。

TaqMan SNP ジェノタイピングアッセイ (Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、米国) を使用してすべてのヒト参加者の ALDH2 ジェノタイピングを実施し、一方、直接 PCR DNA シーケンシングを使用して本研究の実験マウスの遺伝子型を決定しました。ヒト遺伝子型では、ALDH2 rs671 GA および AA 遺伝子型の両方が ALDH2 バリアント (ALDH2 Vt) の保因者として定義されました。 ALDH2 rs671 バリアント A 対立遺伝子または GG 遺伝子型が存在しない場合は、ALDH2 野生型 (ALDH2 Wt) キャリアとして定義されました。ゲノム DNA は、TANBead Blood DNA プレート (Taiwan Advanced Nanotech) を備えた半自動抽出システム (Smart LabAssist、Taiwan Advanced Nanotech Inc.、台湾桃園県) を使用して、各参加者から採取した EDTA 含有全血サンプルから抽出しました。株式会社）。次に、確立された商用サービス (Genomics BioSci & Tech. Co., Ltd.、台湾) を使用して、DNA サンプルの標的多型、各候補遺伝子の ALDH2 Glu487Lys (rs671、G/A) の遺伝子型を特定しました。指定された SNP は、製造元の指示に従って、TaqMan SNP ジェノタイピングアッセイ (Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、米国) 用試薬を使用したリアルタイム PCR ベースの対立遺伝子識別によって決定されました。現在の研究では、TaqMan プローブを使用して ALDH2 Glu487Lys (rs671、G/A) を検査しました。 PCR増幅および対立遺伝子識別は、ViiA7リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を使用して実施した。定量的 PCR 設定は、95 °C で 10 分間の初期変性を伴う 60 °C 30 秒でプログラムされ、その後、95 °C でさらに 15 秒の変性と 60 °C で 1 分間のアニーリングを 40 サイクル行いました。アレル検出とアレル識別は 60 °C で 1 分間実行されました。次に、生データを ViiA7 ソフトウェア (v1.2.4) を使用して分析しました。標的 SNP (ALDH2 Glu487Lys [rs671, G/A]) の解析におけるジェノタイピングの成功率は 96.6% を超え、不一致率は 0.0% でした。マウスの ALDH2 のジェノタイピングでは、KAPA マウスジェノタイピングキット (KAPA Biosystems) を使用してマウスの尾サンプルからマウス DNA を抽出しました。 1 ～ 2 mm 以下の尾端を、88 μl PCR グレードの水、2 μl 10X KAPA Express Extract バッファー、および 2 μl KAPA Express Extract Enzyme を含む 100 μl 容量中で 75 °C で 10 分間消化し、その後95 °C で 5 分間加熱して酵素を不活化します。 PCRは、1×KAPA2G Fast Genotyping Mix中の1μl DNAおよび0.5μMプライマーを使用して実行されました：95℃で5分間変性、35サイクル（95℃で20秒、60℃で20秒、72℃で30秒） )、最終伸長は 72 °C で 5 分間行います。 ALDH2 プライマー EG534 (GTTCTCTCCGATGACAGGATCAACTGCTAC) および EG536 (CAGACATTAACACACTGGGCATTTAGGTC)。 EG534 プライマーによって増幅された PCR フラグメントは、EG535 (TACGTTCCCGTGGGCAGAACTGGTGCCTT)51 を使用して直接配列決定されました。

ヒトのデータは、STATA 14.0 ソフトウェアパッケージ (Stata Corp.、米国テキサス州カレッジステーション) を使用して分析されました。連続データは、特に指定がない限り、平均 ± 標準偏差 (SD) として表示され、スチューデントの t 検定によって比較されます。数値とパーセンテージで表されるカテゴリ値は、必要に応じてカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を使用して比較されました。 ALDH2 多型 (ALDH2 Vt として) と臨床 VA との関連性は、ロジスティック回帰を使用して評価されました。さらに、ALDH2 Vt の存在がアルコール摂取と VA または QTc 延長との関連を変化させるかどうかをテストしました。動物データは、対応のないスチューデントの t 検定またはマンホイットニー U 検定に供され、ECG、ウェスタンブロッティング、免疫共焦点、 ex vivo 電気生理学的 (パスクランプまたは光学マッピング) データ。分析は、GraphPad Prism 8 (GraphPad、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して実行されました。統計分析は両側検定であり、有意性は p < 0.05 に設定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

被験者の機密保持プロトコルの訓練を受けた資格のある研究者からのデータセットへのアクセス要求は、マッケイ記念病院の研究者向け施設内データアクセス/倫理委員会に送信することができます (治験審査委員会の連絡先情報: マッケイ記念病院。住所: No. 92, Sec. 2, Zhongshan N. Rd.、台北市 10449、台湾、電話: 02-25433535#3486~3488、電子メール: [email protected])。図の基礎となるソースデータは補足データ 1 に提供され、ブロットのトリミングされていないバージョンは補足図に提供されます。 11〜15。この研究の結果を裏付ける追加データは、要求に応じて責任著者から入手できます。

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C.-Hさんの作品です。 Chen と D. Mochly-Rosen 本研究は米国国立衛生研究所の支援を受け、研究助成金 AA11147 が D. Mochly-Rosen に授与されました。この研究は、米国科学会議 (NSC) (101-2314-B-195-020、103-2314-B-010-005-MY3、103-2314-B-195-001-MY3、101-) によってさらに支援されました。 2314-B-195-020–MY1)、科学技術省 (MOST) (103-2314-B-195-006-MY3、106-2314-B-195-008-MY2、107-2320-B-) 715-002-MY3、108-2314-B-195-018-MY2、109-2314-B-715-008、110-2314-B-715-009-MY1、110-2320-B-715-002、 111-2314-B-715-013、111-2628-B-715-001-MY3)、マッケイ記念病院 (10271、10248、10220、10253、10375、10358、E-102003、MMH-108-127、MMH) -110-114、MMH-110-03）およびマッケイ医科大学（MMC-RD-108-1B-33、MMC-RD-108-2B-02、MMC-RD-109-1B-18、MMC-RD-） 110-CF-G001-02、MMC-RD-110-1E-P002、MMC-RD-111-1B-P025、MMC-RD-111-CF-G001-02）。

台湾、新北のマッケイ医科大学医学部

アンシェン・リー、クオ・ツー・ソン、チェン・ファン・スー、ユンファン・チェン、ウェイ・ユー・チェン、シーウェイ・ワン、チュン・リー・ホン、フン・イー・イェー

中国医科大学病院循環器内科（台湾、台中）

リー・アンシェン

台湾、新竹の国立陽明交通大学、電気コンピュータ工学部生体医工学研究所

ソン・イェンリン＆リン・シエンフォン

台北医科大学生体医用オプトメカトロニクス大学院研究所（台湾、台北）

イェンリン・ソン

国立台湾大学医学部医学ゲノミクス・プロテオミクス大学院研究所（台湾、台北）

パン・スーファ＆チェン・シュアンレン

ゲノムおよびシステム生物学学位プログラム、国立台湾大学および中央研究院、台北、台湾

パン・ズーファ

国立台湾大学、台湾、台北のトランスレーショナル医学博士号プログラム

パン・ズーファ

台湾、台北のマッケイ記念病院内科、心臓病科

Kuo-Tzu Sun、Cheng-Huang Su、Chung-Lieh Hung、Hung-I Yeh

台湾、新北市、マッケイ記念病院医学研究部

シャオ・リー・ディン、イン・ジュイ・ルー、チン・リン・シェイ

台湾、新北市、マッケイ記念病院生理学検査科

チュアン・チュアン・リウ

台湾、台北市、台北退役軍人総合病院内科、ハートリズムセンターおよび心臓病科

ファ・ポ・チョン

国立陽明交通大学医学部医学科、台北、台湾

ファ・ポ・チョン

台湾、新北、マッケイ医科大学生物医科学研究所

ワン・シーウェイ & フン・チュンリー

スタンフォード大学医学部化学・システム生物学科、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

チェ・ホン・チェン & ダリア・モクリー・ローゼン

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執筆—原案、ASL。プロジェクト管理、ASL、YJL、CLH (Chin-Ling Hsieh)。形式分析、YLS、および SHP。データキュレーション、KTS、CHS。検証、SLD、および WYC。ソフトウェア、YFC、SWW。監督、CCL、HIY。執筆 - レビューと編集、XRC、FPC、および CLH (Chung-Lieh Hung)。資金調達、CHC、DMR、CLH (Chung-Lieh Hung)。方法論、ASL、YLS、SHP。概念化、CLH (Chung-Lieh Hung) および HIY。リソース、HIY、および SFL。パッチクランプ、ASL。光学マッピング、YLS。免疫共焦点イメージング、SHP 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Chung-Lieh Hung または Hung-I Yeh への対応。

この研究は、台湾、台北のマッカイ記念病院からの研究助成金によって支援されました。競合利益の宣言: CH Chen および D. Mochly-Rosen は、ALDA-1 による ALDH2*1 および ALDH2*2 の活性化に関する特許を保有しています。特許の 1 つは、D. Mochly-Rosen がコンサルタントを務める Foresee Pharmaceuticals にライセンスされています。しかし、同社は研究に含まれる実験には一切関与していない。他の寄稿者は、これらの結果の出版に関して利益相反はないと主張しました。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: George Inglis。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

AS. リー、YL. ソン、SH. パン他。東アジアに共通するアルデヒドデヒドロゲナーゼ 2*2 変異体は、マウスにおける軽度から中度のアルコールの慢性使用により心室不整脈を促進します。 Commun Biol 6、610 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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受信日: 2022 年 2 月 25 日

受理日: 2023 年 5 月 26 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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